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全自动生化分析仪双速率法检测G6PD的探讨

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  诊断红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏的方法很多,其中G6PD活性检测是一种较为常用的定量检测方法。以往G6PD活性检测采用手工法,操作起来比较费时、费力,人为因素引起的误差较大。根据酶法的测定原理,在传统手工方法的基础上,应用生化分析仪采用双通道单速率分别检测总G6PD和6PGD,两者相减得到G6PD活力。此法与手工法相比,快捷、准确、简便,但因占用两个通道,所使用的试剂量和样本量相应增加,仪器损耗也增加,仍有待改进

  在国内诊断匍萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏的方法较多,以往多采用高铁血红蛋白还原试验,但准确度差、敏感度低、容易漏诊 ;G6PD定量比值法简单,价格低廉,适宜在基层医院开展,但准确性相对较差,存在假阳性或假阴性;基因检测准确性高,是一种灵敏、特异而快速的诊断技术,但需要一定的技术和设备;手工法直接检测G6PD活性虽较准确,但操作步骤多,费时费力,精确度差。有研究以《全国临床检验操作规程》的手工法检测G6PD活性为基准,在7600全自动生化分析仪上采用双速率法检测G6PD活性,简便、快捷、准确。

  G6PD双速率法是在连续监测法(即速率法)的基础上,利用自动化生化分析仪提供分析方法模式中灵活应用。在反应杯里,反应开始时加入R1试剂,仪器测出其速率6PGD(△A ),然后在第5 min加入R3试剂,仪器测出其速率G6PD和6PGD(△A )作为总速率(进行体积校正),△A -△A 即为G6PD 的速率。该研究采用双速率法检测的92例标本中,既有正常标本,也有高值和低值标本,所得结果与根据传统G6PD酶活性测定而设计的双通道单速率法结果相比较,差异无统计学意义(P0.05),并且两者相关性良好(r=0.9705)。! l; b5 o0 }% v8 A. Q

  双速率法在日立自动化生化分析中又称为速率A法,也可称为扣减空白速率法。本组为了强调在一个反应进程里出现两个速率而称其为“双速率”,许多仪器都具有双速率法的功能。双速率法可以进行样品空白校正,本组是以R1试剂检测出6PGD的速率,并当作样品空白反应速率来扣除得到G6PD酶活性。在反应进程的读点时,共监测34个点(第26、27点不读),每一个反应期内有17个点(约5 min),用作计算吸光度变化值△A的点为5个,在一个反应期内,不可能每个点都呈零级线性关系,某些线性不太好的点也用作计算△A 的话,反而会影响结果的准确性。因此,简便办法从反应曲线中观察,计算△A 的两个线点)。通过选择线性反应期内线性最好的连续几个点来计算△A值,直观且简便。9 m& B n! _: u4 y8 D1 q2 S

  双速率法检测G6PD的不足之处是:虽然能检测出6PGD的速率,但不能算出6PGD 的线PD酶活性;因此,不能利用G6PD/6PGD 的比值进行临床分析或诊断。同时,受到仪器设备参数的限制,试剂用量及总反应体积量受到制约,20 L≤VR1和VR。≤270 uL,150 L≤V总≤380 L,因此在试剂配制及参数设置时,既要处理好反应物浓度之间量的关系,也要调整好试剂用量及总反应体积,使其在仪器可接受的范围内,以保证顺利完成样本检测。通常仪器反应时间为10 min,可以根据需要延长至22 min,保证反应完全,但检测速度受到影响。; o) ?5 f \& V4 B* J/ b/ T

  另外,从反应曲线PGD的吸光度增加,对第二反应G6PD和6PGD的吸光度有叠加作用,产物NADPH浓度堆积可能会对后面反应产生一定影响,同时,R3试剂加入具有稀释作用从而降低吸光度的叠加作用和产物NADPH 浓度堆积的影响。本实验采用过量底物G6P Na2。和6PGA Na3保证反应处零期,呈线性变化。

  K# S* ?3 I) T本组将G6PD酶活性直接测定应用到7600全自动生化分析仪上,采用单个通道的双速率法检测G6PD活性,可取代手工方法的检测,准确、简便、快捷;与自动生化分析仪的双通道速率法检测相比较,既减少了一个检测通道,又减少了试剂用量,仪器损耗也同时减少,检测成本降低,可作为一种更为经济且实用性较强的G6PD

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